Флуоресцентна микроскопија: принципи на методот

Апсорпцијата и понатамошната реерадијација на светлината од неоргански и органски медиуми е резултат на фосфоресценција или флуоресценција. Разликата меѓу феноменот се состои во времетраењето на интервалот помеѓу апсорпцијата на светлина и емисијата на флуксот. Под флуоресценција, овие процеси се случуваат речиси истовремено, и со фосфоресценција, со одредено задоцнување.

Историско потекло

Во 1852 година британскиот научник Стоукс првпат ја опиша флуоресценцијата. Тој воведе нов термин како резултат на изведуваните експерименти со флуопар, кој емитирал црвена светлина под влијание на ултравиолетовите. Стоукс забележа интересен феномен. Тој открил дека брановата должина со флуоресцентно зрачење е секогаш поголема од онаа на флуксот на возбуденоста.

За да се потврди хипотезата во 19 век, беа спроведени многу експерименти. Тие покажаа дека голем број примероци флуоресцираат под дејство на ултравиолетовите. Меѓу материјалите, меѓу другите, се и кристалите, смолите, минералите, хлорофилот, лековити суровини, неоргански соединенија, витамини, масла. Директна примена на бои за вршење на биолошки анализи започнала само во 1930 година.

Флуоресцентна микроскопија: опис

Некои од материјалите користени во студиите од првата половина на 20 век имале висока специфичност. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Поради индикатори кои не можат да се постигнат со контрастни методи, методот на флуоресцентна микроскопија стана важен инструмент и за биомедицинските и за биолошките истражувања. Добиените резултати не беа од мала важност за науката за материјали.

? Кои се предностите на флуоресцентната микроскопија ? Со помош на нови материјали стана можно да се изолираат високо специфични клетки и субмикроскопски компоненти. Флуоресцентен микроскоп може да открие индивидуални молекули. Различни бои овозможуваат идентификација на неколку елементи во исто време. И покрај ограничената просторна резолуција на опремата со границата на дифракција, што, пак, зависи од специфичните својства на примерокот, исто така е можно да се детектираат молекули под ова ниво. Различни примероци по зрачење покажуваат автофлуоресценција. Овој феномен е широко користен во петрологија, ботаника, полупроводничка индустрија.

Карактеристики

Студијата за животински ткива или патогени микроорганизми често се комплицира со премногу слаба или многу силна неспецифична авто флуоресценција. Меѓутоа, значајноста во студиите е воведувањето во материјалот на компонентите возбудени на одредена бранова должина и емитување на светлиот флукс од потребниот интензитет. Флуорохромите делуваат како бои кои се способни да се поврзат со структури (невидливи или видливи). Во исто време, тие се многу селективни во однос на целите и квантниот принос.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Флуоресцентна микроскопија стана широко користен со доаѓањето на природни и синтетички бои. Тие имале дефинитивни профили на интензитет на емисија и возбуда и биле насочени кон специфични биолошки цели.

Идентификација на поединечни молекули

Често, во идеални услови, можно е да се регистрира сјајот на поединечен елемент. За да го направите ова, меѓу другото, неопходно е да се обезбеди доволно низок детектор шум и оптичка позадина. Молекулата флуоресцеин пред уништувањето поради photobleaching може да емитува до 300 илјади фотони. На 20% од собирањето и ефикасноста на процесот, тие може да се регистрираат во износ од околу 60 илјади.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Флуоресцентната микроскопија , базирана на лавински фотодиоди или електроничко множење, им овозможи на истражувачите да ги набљудуваат однесувањето на индивидуалните молекули во секунди, а во некои случаи дури и минути.

Тешкотии

Клучниот проблем е сузбивањето на бучавата од оптичката позадина. Поради фактот што многу од материјалите што се користат во дизајнот на филтрите и леќите покажуваат некои автофлуоресценции, напорите на научниците во почетните фази се фокусираа на производство на компоненти кои поседуваат ниска флуоресценција. Сепак, последователните експерименти доведоа до нови заклучоци. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Особено, беше откриено дека флуоресцентната микроскопија , базирана на тотална внатрешна рефлексија, постигнува ниска позадина и возбудлив лесен флукс со висок интензитет.

Механизам

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Принципите на флуоресцентна микроскопија , базирани на тотална внатрешна рефлексија, се состојат од употреба на бран што брзо се распаѓа или не се размножува. Се појавува на границата на медиумите со различни рефрактивни индекси. Во овој случај, светлосниот зрак поминува низ призмата. Таа има висок индекс на рефракција.

Призмата е прикачена на воден раствор или на стакло со низок параметар. Ако протокот на светлината е насочен кон него под агол поголем од критичниот, зракот целосно се рефлектира од интерфејсот. Овој феномен, пак, предизвикува нераспространет бран. Со други зборови, генерира електромагнетно поле кое продира во медиумот со помал индекс на рефракција на растојание помало од 200 нанометри.

Во непроменлив бран, интензитетот на светлината ќе биде сосема доволен за да ги возбуди флуорофорите. Сепак, поради неговата исклучително незначителна длабочина, нејзиниот волумен ќе биде многу мал. Како резултат на тоа, се појавува позадина на ниско ниво.

Модификација

Флуоресцентна микроскопија, базирана на тотален внатрешен одраз, може да се реализира со помош на epi-осветлување. Ова бара леќи со зголемена нумерички отвор (најмалку 1,4, но пожелно е да достигне 1,45-1,6), како и делумно осветлено поле на уредот. Вториот се постигнува со користење на место на мала големина. За поголема униформност, се користи тенок прстен, преку кој дел од протокот е блокиран. За да се добие критичен агол, по што се случува комплетна рефлексија, потребен е висок степен на рефракција на потопувачкиот медиум во леќите и капакот на микроскоп.