Молекуларна метод генетски истражувања

Да се истражуваат и да ги идентификуваат варијанти во ДНК структура користи молекуларни генетски метод. За секоја DNA регион, кој го истражува овој регион на хромозомот, ген или алел, методите се разликуваат. Во основата на секоја молекуларни генетски метод се состои од некои или други манипулација на РНК и ДНК. Сите овие методи се карактеризираат со огромна комплексност, без лабораториски услови не може да се врши, како и персонал мора да биде високо квалификувани. Оваа работа се врши во неколку фази.

фази

Прво, РНК или ДНК примероци да се произведува. Тука, молекуларна генетски метод може да се примени практично било каков материјал: капка крв, леукоцити, фибробластите култура, мукоза (добиеше), дури и фоликулите на косата, - ДНК може да се добијат од било кој примерок. Таа е погодна да се користи било молекуларни генетски методи и нивните различни опции и веќе долго време изолирани ДНК се чуваат замрзнати. Втората фаза е посветена на акумулација на саканата фрагменти (засилување) на ДНК, како што помага да се обезбеди на полимераза верижна реакција на ин витро (ин витро без учество на жив организам). Како резултат на тоа, избраниот ДНК фрагмент множи со оваа верижна реакција, и износот на ДНК се зголемува буквално милиони пати.

Третиот чекор во методите на молекуларни генетски истражувања се претпоставува множи ДНК ограничување (оваа фрагментација, кинење или сечење). Ограничување врши од страна на електрофореза на polyacrylamide или агарозен гел. Ова молекуларно-генетска метод на проучување на ДНК фрагмент им овозможува на секој да се земе одредена позиција во гел. После тоа, гел се третира со ethidium бромид, способен за врзување на ДНК, на зрачење со ултравиолетова светлина, тогаш тоа е можно да се набљудуваат Луминисценција делови. Молекуларни генетски дијагностички методи се разновидни и многубројни, но првите два чекори се заеднички за сите. Но, со цел да се идентификуваат ДНК фрагменти, гел може да се обоени и многу други постоечки методи.

видови

На најдиректен и широко распространета методи за откривање на микобактерии може да вклучуваат горенаведените метод на учење молекуларни генетски ДНК. Нејзината суштина е во тоа што, со цел да се идентификуваат скенирање синџир материјал на одредени делови од ДНК на патогени. Молекуларни генетски дијагностички техники сеуште не ги имаат поефикасен начин да го признае болести како туберкулоза. Користење на полимераза верижна реакција (PCR), можете да бидете сигурни дека оригиналниот ДНК ќе се зголеми бројот на копии во милиони пати, што е, ќе има засилување, и тоа ќе се прикаже резултатите. ниво на чувствителност е многу висока - повеќе од деведесет и пет отсто, што е главната предност на овој метод.

Остатокот од молекуларни генетски методи на истражување за ефикасноста на принос на повеќе копии буквално двојно се зголеми, бидејќи во овој случај примерокот за изработка покажува конкретен олигонуклеотидна секвенца се зголеми на 106 пати. Дури и дијагноза култура на туберкулоза на респираторниот систем значително да го намали неговата чувствителност. Ова е причината зошто модерната медицина се базира на молекуларни генетски методи за дијагноза на туберкулозата. А што е опишано метода е ефикасна, особено кога се работи со патогени на високо антигенски варијабилност, се утврди дека на друг начин е многу потешко - бара посебни хранливи медиуми и зачувување долго време. Биохемиски и молекуларни генетски методи за производство на многу различен ефект врз резултатите.

дијагноза на туберкулоза

Маршал PCR дијагноза на туберкулозата најчесто со користење на овие ДНК секвенци кои се специфични за сите четири видови на болеста. За да се постигне оваа цел, често ги користат буквари кои детектираат низа Е елементи (Е-986, Е-6110), како овие елементи се карактеризира високо миграторните видови Mycobacterium tuberculosis и секогаш присутна на повеќе копии во геномот. Исто така, екстракција на ДНК може да се врши од чисти култури и клиничка (спутум на пациенти) со кој било друг соодветен метод. На пример, постои метод Boom каде што пуферот лиза се користи врз основа на тиоцијанат на гванидин и силициум диоксид како ДНК на превозникот. Бројот на пациенти кои се разликуваат сиромашните бактериолошки зголемува секоја година, а со тоа и во клиничката пракса има воспоставено сосема различно ниво на организација: молекуларно-генетска метод на проучување на ДНК е игра голема улога во дијагнозата.

Сепак, мора да се признае дека тоа не е без недостатоци. Методот на PCR е употребата на често носи голем број на лажно позитивни резултати, а причината не е само технички грешки, но, исто така, карактеристиките на самиот метод. Покрај тоа, со користење на овој метод на дијагноза за да се утврди на одржливост на микобактерии, кои се идентификувани, тоа е едноставно невозможно. Но, овој недостаток не е најважен. Молекуларна генетски методи на PCR дијагностика резултира со ризик од контаминација на микобактериска ДНК. условите за сертификација за оваа причина што за PCR лаборатории наменета исклучиво тешко, тие бараат три одделни простории. PCR технологија е модерен и многу сложен, што бара употреба на соодветна опрема и обучен персонал.

bacterioscopy

Кога резултатите од дијагнозата на анализа мора да се во споредба со другите податоци: клинички преглед, радиографија, тест микроскопија, култура, па дури и одговор на одреден третман, се многу важни. Во оваа серија, студиите PCR е само една од компонентите. Откривање на патогени во рана дијагноза може да биде наједноставниот и најбрзиот методи - бактериолошки.

Таму се користи светлина микроскоп (боење Ziehl-Neelsen) и флуоресцентни (боење fluorochromes). Предноста е во брзина тест резултатите. Но неговата шкарт е со право се смета за ограничен капацитет се должи на ниската чувствителност. Меѓутоа, овој метод е дадена препорака на СЗО како најекономичен и земјата да се открие пациенти туберкулоза. Откривање на микобактерии бактериолошки метод има предвидување вредност и проценетата квантитативно бактериски екскреција. Многу посигурни да се справи со тоа молекуларни генетски методи на истражување на туберкулозата.

култури

Подобра детекција на микобактерии признае културни студии. Сеење патолошки материјал што е направен во средно јајце: Mordovsky, Финецот II, LJ, и слично. Одредници на отпорност на микобактерии на лекови и индиректни докази за ефикасноста на голем број на микобактерии и нивните колонии in vitro, ако се примени методот на истражување култура. За да го зголемите процентот на изолација на микобактерии инокулација на патолошки материјал ќе се одржи на различни средини.

Задоволување на потребите на голем број на културни, патогени вклучувајќи грантови и течности. Се користи во овој систем и раст автоматски Тип на мерење на VANTES. Култури мора да се одржи во инкубација за седум до осум недели. Во тоа време на култура со недостатокот на раст може да се смета за негативен. Најефективен начин да се открие Mycobacterium tuberculosis разгледа биолошки примероци: дијагностички материјал зарази заморчиња, кои се исклучително осетливи на ТБ.

некои личности

Интересна област на студии, кој беше отворен со PCR дијагностика е да се учат на M. tuberculosis - латентна инфекција. Современиот концепт на ТБ инфекција укажува на тоа дека од сто луѓе кои биле во контакт со M. tuberculosis, деведесет и може да се заразени, но само десет од нив се активни болест се развива. Други имаат ТБ имунитет и поради деведесет проценти од случаите на инфекција останува латентна. Откривање на моделот што им помогна на молекуларни генетски метод.

Генетичарите се каже дека педесет и пет проценти од оние чии култури патолошки материјал биле негативни, осумдесет отсто од луѓето инфицирани со M.tuberculosis, но тече без радиографски манифестации на болеста, PCR позитивни одговори добиле. Тоа е генетски дијагностички метод помогна да се идентификуваат пациентите со ризик со PCR студии, со резултатите од нивните анализи (микроскопија и култура), биле негативни, а субклиничка инфекција M. tuberculosis, беше присутен.

современите истражувања

Руската Федерација и бактериолошките лаборатории користиме забрзан метод на апсолутна концентрации: нитрат редуктаза активност на тестирани од страна на Griess реагенс микобактерии. Анти-ТБ центри користат метод кој овозможува да се одреди отпорност на лековите. Ова сеење во течни медиуми, каде што автоматски термовизиските и флуоресцентни сметководствен систем раст на микобактерии. Таквата анализа се врши брзо - до две недели.

Во моментов, се развиваат нови методи: отпорност на лековите на микобактерии се мери на ниво на генотипот. Студија на молекуларните механизми на отпорност на гени и покажува присуство во микобактерии. Овие гени се поврзани со отпорност на одредени лекови. На пример, kasa гени, inhA, katG отпорни на изонијазид, rpoB ген - рифампицин 16Sp РНК гени и rpsL - стрептомицин, emb1 - да етамбутол, gyrA - на флуорокинолон и така натаму.

мутации

Модерната дијагноза значително зголемување на методот на молекуларни генетски ниво за проучување на ДНК и е дозволено да вршат големи истражувања на мутации во сите нивни спектар. Сега знаеме дека најчестите мутации во 516, 526 и 531 кодони генот rpoB и идентификувани на отпорност на разни лекови. Постои цела низа на методи за пишување на микобактерии, со користење не само на традиционалните методи - биохемиски, биолошки и културни, но исто така широко се користи модерни молекуларни генетски техники. Веќе постојат соодветни и да се обезбеди точни метод на дијагноза за откривање на моногенски болести. Тие се базираат на ДНК студии во конкретната површина на одреден ген. Ова најчесто е сложен процес, одзема време и скапи, но податоците кои се обезбедени од страна на молекуларно-генетска анализа, е многу повеќе прецизни и информативни од податоците од сите други анализи.

Тоа одамна е познато дека ДНК не се менува за целиот живот на организмот дека е во било нуклеирани клетки odnakova, и тоа го прави можно да се преземат анализа на апсолутно сите клетки во телото, во која било фаза на онтогенезата. На оштетениот ген може да се открие пред појавата на првите симптоми на клиничката болест полн обем, како и кај здрави хетерозиготна луѓе, но имаат мутација во генот. Молекуларна дијагностички методи генетски наследна болест овозможи да го открие својот (директен пристап, ДНК-дијагностика), како и да се анализира сегрегација на болеста во семејството со маркер локуси ДНК (генетски полиморфизми), кои се тесно поврзани со оштетен ген (односно, на индиректен пристап на ДНК-дијагностика). Директно или индиректно - било ДНК дијагностика е врз основа на методите за идентификација на строго дефинирани дел од човечката ДНК.

директни методи

Директни методи на ДНК дијагноза кога се наследни болести виновникот ген е познато, како што е позната, и видови на нејзините мутации. На пример, соодветен директни методи во голем број на болести. Ова Хантингтоновата хореа (продолжување CTG-повторувања), фенилкетонурија (R408W), цистична фиброза (delF508, големи мутации) и слично. Главната предност на директна метода е целосно во сопственост на дијагностичката точност, и нема потреба да се направи ДНК анализа на остатокот од семејството. Ако се утврди дека мутација во соодветните ген, што им овозможува точно одобри дијагноза на наследноста, определување генотип за остатокот од оптоварени семејство.

Друга предност на директните дијагноза се смета да се идентификуваат со хетерозиготна носител на лоши мутации од роднини и родители кои умреле од болеста. Ова е особено точно за болести автосомно рецесивно. Недостатоци на директни методи се исто така достапни. Да ги применуваат, треба да се знае точно локализираат абнормални ген ексон-интрон структура на спектарот и нејзините мутации. Не сите моногенски болести денес добиле такви информации. Informativeness директни методи не може да се смета за целосно, бидејќи еден ист ген може да има голем број на патолошки мутација која предизвикува развој на наследни болести.

индиректни методи

Индиректни методи во ДНК дијагностика се користи на сите, во други случаи, ако оштетениот ген не е идентификуван, но само хромозомски или ако дијагнозата на линијата не даде резултат (тоа се случува, ако генот комплексен молекуларен организација или во голема мера, ако има многу патолошки мутации). Индиректни методи врши сегрегација анализа на полиморфни маркери во алелни семејство. Маркери се наоѓаат во иста хромозомски регион или локус е тесно поврзана со болеста и претставуваат бришења или инсерции, точка замени, се повторува, и нивните полиморфизам се должи на различни количина на клетки во блокот.

Најзгодно за индиректна дијагноза смета микросателитски и minisatellite полиморфизми, кои се широко распространети во човечкиот геном. нивната вредност изразена во висока содржина на информации, ако штета на генетски растојанието помеѓу означувачот и генот не е премногу голем. Во вториот случај, точноста на проценката се одредува во голема мера на фреквенцијата на рекомбинација помеѓу полиморфни маркери и оштетување. Индиректни дијагностички методи, исто така, обезбеди задолжителна претходна чекор на алелите фреквенции од анализираните студија населението меѓу пациентите и носители на мутации, плус на потребата од утврдување на веројатноста за рекомбинација на nonequilibrium и адхезија маркери и мутирани алели.

други методи

Кратки сегменти на РНК или ДНК, како и еден ген визуелизира под микроскопски студија не може да биде, затоа, да се идентификуваат мутациите потребни од страна на молекуларна генетска дијагноза. Постои "Проектот за човечкиот геном", како и други напредокот во молекуларната генетика голема мера се прошири можноста за дијагноза на наследни болести - и двете пред и постнаталниот. Овие методи може да обезбеди рано откривање и направи предвидување поли и моногенски болести, чие деби се одвива во зрелоста. За жал, поради техничките способности на молекуларни генетски истражувања понекогаш се надвор од етички граници кои се поставени во однос на наследство, особено кога дијагнозата е во адолесценцијата и детството.

Структурни и нумерички хромозомски абнормалности се најчестите причини за болести и рак, и многу малформации. Хромозомски аберации треба да бидат идентификувани, што е важно за семејно советување - да се процени прогноза, заедно со репродуктивното ризик во идните бремености. анализа на хромозомот е "златен стандард" на генетска дијагноза, но тоа е ограничен. Само методи на молекуларно-генетска анализа може да се направи повеќе, бидејќи таму се користи за клонирање технологија базирана флуоресцентни етикети способен за нивната висока чувствителност за да се идентификуваат суптилни хромозомски промени кои се невозможно да се открие класична цитогенетски студии. Овие техники се повеќе проширување на нашата дијагностички можности, кога се испитуваат, деца со пречки во развојот, ментална ретардација, со многу други наследни болести.

наодите

Тоа е многу важно за човештвото беа ген структура и функција на знаење, видови на варијабилност, способност да се детектираат наследни болести што се случи во врска со развојот на молекуларната генетика. неговите методи се во насока на истражување на ДНК молекулата - и кога тоа е нормално, а кога тоа е оштетена. Подготовка на секвенци на нуклеотиди деоксирибонуклеинска киселина (ДНК) се протега во фази од добивањето на примероци за да се идентификуваат поединечни фрагменти. Изолација на геномската ДНК од клетките, ограничување (кинење), засилување (клонирање), електрофореза на фрагменти (одделување на нивните електрично полнење и молекуларна тежина од страна на агарозен гел). Идентификација на специфични фрагменти се наоѓа на површината на дискретни лента.

Потоа влезе во чин специјални филтри, преку која поминува секој фрагмент хибридизација со клонирани ДНК фрагменти или синтетички радиоактивни сонди е контрола, која ќе биде еднаква на секој тест примерок. Ако го промените позиција или должина во однос на истрагата, доколку нов фрагмент или исчезнаа - сето тоа укажува на тоа дека анализираните ген претрпе преструктуирање во нуклеотидната секвенца. Постојат осум основни техники на молекуларни генетски студии: секвенционирање (определување на ДНК секвенца), полимераза верижна реакција (зголемување на бројот на секвенци), подготовката на прајмери кој се познати гени, ДНК клонирање, за производство на рекомбинантен молекули добиени протеини се должи на рекомбинантен молекули, создавањето комплетен сет (собирање библиотека) клонирани фрагменти, кои се добиени со користење на ограничување.